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人外周血淋巴細胞分離液說明書

【包裝規格】

   200ml/瓶

【貨號】

   LTS1077-1

【適用儀器】

  zui大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機

【檢驗方法】

全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。

通用實驗方法

1、取 2ml 新鮮抗凝血與 2ml 樣本稀釋液（產品編號：2010C1119）混勻。

2、取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液，用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液之 

 液面上，400g，30-40min。

3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4、取白環層，加入 3 倍體積的清洗液（產品編號：2010X1118）混勻，60-100g，離心 10min，棄上清。

5、加 6-8ml 清洗液（產品編號：2010X1118）混勻，60-100g，離心 10min，棄去上清，后

以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸目的細胞。

注：血液樣品量增大時，可通過改變離心管直徑的方法始終保持樣本量高度與分離液高度為

2.4cm 與 3cm，其他分離條件不變。

為滿足客戶實際使用需求，灝洋根據不同血液樣本量推薦具體實驗操作方法如下：

一、 使用 15ml 離心管時：

情況 A：血液樣本量小于 3ml 時，實驗方法如下：

1、取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果）。

3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環狀乳白色淋巴

細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118），混勻細胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8、250g，離心 10min。

9、重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。

情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時，實驗方法如下：

1、取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，450-650g，離心 20-30min（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。

3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118），混勻細胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8、250g，離心 10min。

9、重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。

二、 使用 50ml 離心管時：

情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時，實驗方法如下：

1、取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據血液樣    本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自    行摸索，以達到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。

3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環狀乳白色淋巴

細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118），混勻細胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8、250g，離心 10min。

9重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。

情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時，實驗方法如下：

1、取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2、用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-1100g，離心 20-30min（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。

3、離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4、用吸管小心吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118），混勻細胞。

5、250g，離心 10min。

6、棄上清。

7、用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8、250g，離心 10min。

9、重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。

【注意事項】

1、全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得*的實驗結果，在取血 2h 內進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

2、本實驗不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

3、吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加。

4、吸取過多的淋巴細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。

5、如所實驗后細胞得率或活性過低，請天津灝洋以尋求幫助，具體詳見下方生產企業信息。

6、當血液樣本粘度過高需稀釋時，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產品編號：2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當的稀釋方法會降低細胞得率及活性。如血液樣本經過稀釋則分離過程中需適當降低離心力和離心時間。

7、因血液樣本的個體差異及血液粘度不同，需調整離心力及離心時間，離心力zui大不超過

1000g。

【儲存條件及有效期】

常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶可適當進行參考。

【相關實驗技術方案】

1、所獲得淋巴細胞的培養技術。

2、所獲得淋巴細胞的核酸提取技術。

3、所獲得淋巴細胞的鑒定方法、A.流式細胞技術B.免疫組化技術C.原位雜交技術D.PCR 技術

【可能存在的問題及解決方法】

1.  由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

• 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離心時間，對離心轉速進行調整。

• 本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可能出現紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉速。

注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數，直至達到*分離效果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。