流感病毒分離標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 轉(zhuǎn)
病毒分離
分離病毒是診斷病毒性疾病zui常用，并且高度敏感的方法之一。分離出的病毒須經(jīng)免疫
學(xué)、基因分析或電子顯微鏡等進(jìn)一步鑒定確診。病毒可長(zhǎng)期保存，亦可用來作抗原性、
基因特性或藥物敏感性等分析。病毒分離亦受一定限制。目前用于分離病毒的組織細(xì)胞
種類有限，每種細(xì)胞只能用來分離培養(yǎng)一或數(shù)種病毒。MDCK（狗腎細(xì)胞）是目前用于分
離培養(yǎng)流感病毒zui常用的細(xì)胞系。
分離流感病毒zui常用的活體是雞胚，目前有些實(shí)驗(yàn)室用MDCK細(xì)胞代替雞胚分離培養(yǎng)流感
病毒。由于MDCK細(xì)胞屬腫瘤細(xì)胞系，故用該細(xì)胞分離的病毒不能用于疫苗生產(chǎn)。各實(shí)驗(yàn)
室應(yīng)同時(shí)采用雞胚和MDCK兩種方法分離病毒，不應(yīng)放棄用雞胚分離病毒的方法。
流感病毒細(xì)胞分離標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程
材料：1、細(xì)胞瓶或細(xì)胞管培養(yǎng)成片的MDCK細(xì)胞
2、TPCK處理胰酶（牛胰腺來源XIII型）Sigma Cat. # T-8642
3、HEPES 緩沖液, 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-023
4、D-MEM培養(yǎng)基，GIBCO BRL Cat. # 11965-092
5、青、鏈霉素母液（10,000 U/ml 青霉素 G; 10,000 ?g/ml 硫酸鏈霉素） ，GIBCO BRL
Cat. # 15140-023
6、牛血清白蛋白組分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-011
7、放置于2ml wheaton 小瓶中的臨床樣品
8、T-25培養(yǎng)瓶用于病毒培養(yǎng)，（組織培養(yǎng)管也可被應(yīng)用，若樣本量大的話應(yīng)選用培養(yǎng)瓶
，細(xì)胞數(shù)量按規(guī)定調(diào)整。）
9、1ml 滴管
10、10ml 滴管
培養(yǎng)基和試劑的準(zhǔn)備：（建議：要求經(jīng)常檢查試劑使用的有效期）
500 ml D-MEM液中加入：
青、鏈霉素母液5 ml （終濃度達(dá): 100 U/ml 青霉素and 100 ?g/ml 鏈霉素）
牛血清白蛋白12.5 ml （終濃度: 0.2 %）
HEPES緩沖液12.5 ml （終濃度: 25 mM）
病毒生長(zhǎng)液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液濃度為2m
g/ml ）使TPCK-胰酶的濃度為2 ?g/ml。
方法：（所有有關(guān)病毒分離的操作都應(yīng)在生物安全Ⅱ?qū)嶒?yàn)室中進(jìn)行，必須遵守生物安全
規(guī)定，嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定。進(jìn)入生物安全Ⅱ?qū)嶒?yàn)室要求著必要的
個(gè)人防護(hù)用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防護(hù)眼鏡）
程序：
Ⅰ 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的準(zhǔn)備
1、顯微鏡檢查細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，40倍放大。
2、用病毒培養(yǎng)液替代細(xì)胞生長(zhǎng)液，保證使用合適的病毒培養(yǎng)基。
3、輕輕倒出細(xì)胞生長(zhǎng)液于廣口瓶中，用6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的D-MEM液洗細(xì)
胞3遍。
Ⅱ 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種
1、用無菌的移液管將D-MEM從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中移出。
2、用無菌的移液管吸取200 ?l臨床樣品置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。
3、接種物370C吸附30分鐘。
4、加6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的不含小牛血清的*D-MEM液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。
5、每細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲日檢測(cè)細(xì)胞病變。（細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙
增大。細(xì)胞核固縮或破裂。嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落）
Ⅲ 細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲
1、當(dāng)細(xì)胞病變?yōu)?+或4+時(shí)，收獲細(xì)胞懸液并加穩(wěn)定劑如：甘油或終濃度為0.5%的牛血清
白蛋白。即使無細(xì)胞病變也應(yīng)該于6-7天收獲。
2、進(jìn)行紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)并40C保存。如沒有紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象在報(bào)告不能從樣品中分離病
毒前，應(yīng)再傳代2-3次。
3、如果有必要，應(yīng)3000轉(zhuǎn)離心5分鐘以去除剩余的細(xì)胞。通過血凝抑制實(shí)驗(yàn)鑒定分離物
，并在收獲的一天間將分離物保存在-70oC條件。
流感病毒雞胚分離標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程
材料：雞胚10日齡
照卵燈
70%酒精
針頭, 22 號(hào), 1? 英寸
1ml注射器
雞卵開孔器
膠水或清漆
15ml 管和架子
10ml 移液管
無菌鑷子
方法：（所有有關(guān)病毒分離的操作都應(yīng)在生物安全Ⅱ?qū)嶒?yàn)室中進(jìn)行，必須遵守生物安全
規(guī)定，嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定。進(jìn)入生物安全Ⅱ?qū)嶒?yàn)室要求著必要的
個(gè)人防護(hù)用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防護(hù)眼鏡）
程序：
I.驗(yàn)卵
1、用照卵燈檢測(cè)雞胚，并將雞胚的盲端放置在蛋盤上。
2、如果雞胚是沒有受精、有裂痕、發(fā)育不全、或表面有好多滲水孔，應(yīng)掉。
II.雞胚接種
1、將雞胚的盲端放置在蛋盤上，標(biāo)記每個(gè)雞胚用特定的鑒定數(shù)量（通常每個(gè)樣本接種3
個(gè)雞胚）。
2、用70%乙醇消毒雞胚，在氣室端鉆孔。每份標(biāo)本接種3個(gè)雞胚。
3、用注射器吸1ml處理過的臨床標(biāo)本，裝上22 號(hào)（ 1? 英寸）針頭。
4、將雞胚置于蛋架上，用短促動(dòng)作刺破雞胚羊膜，將100 ?l臨床標(biāo)本注入雞胚羊膜腔。
將針頭退出至? 英寸，將另外100 ?l臨床標(biāo)本注入雞胚尿囊腔。
5、用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種另外的兩枚雞胚。
6、將針頭棄于合適的生物安全裝置中。
7、滴石蠟或膠水封口。
8、33-34oC 溫箱培養(yǎng)雞胚2-3 天。
提示：禽流感需35?C or 37oC培養(yǎng)，哺乳動(dòng)物流感病毒35oC培養(yǎng)（禽流感在35?C也會(huì)生
長(zhǎng)良好！）
III.雞胚收獲
1、雞胚在收獲前應(yīng)4oC過夜或至少放置4小時(shí)。
2、標(biāo)記15ml 塑料管與相應(yīng)的雞胚編號(hào)一致。用70%乙醇消毒雞胚頂部。
3、用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10ml 吸管吸雞胚尿囊液置于相
應(yīng)的收集管中。用注射器和針頭刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。由于
羊水較少可以將3個(gè)雞胚的羊水合并。
4、將雞胚收獲液3000轉(zhuǎn)離心5分鐘去除血液和細(xì)胞。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)并4oC孵育30分
鐘。如沒有紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象在報(bào)告不能從樣品中分離病毒前，應(yīng)再雞胚傳代2次。
5、如果有必要，應(yīng)3000轉(zhuǎn)離心5分鐘以去除剩余的細(xì)胞。通過血凝抑制實(shí)驗(yàn)鑒定分離物
，并在收獲的一天間將分離物保存在-70oC條件下。
注意事項(xiàng)
I.不要在-20oC條件下保存病毒分離物，應(yīng)該溫度條件下流感病毒極不穩(wěn)定。
II.流感病毒實(shí)驗(yàn)室毒株和臨床檢測(cè)樣本的交叉污染問題：流感病毒操作要求生物安全規(guī)
程。當(dāng)在同一工作區(qū)域內(nèi)操作臨床樣本和已知流感病毒時(shí)應(yīng)該有特殊警示。有些實(shí)驗(yàn)室
用已知的病毒作為陽性控制，而且有將商用推薦病毒作為質(zhì)量確證程序。這些病毒由于
其極優(yōu)的生長(zhǎng)特性被選擇出來。因此這些毒株常與臨床檢測(cè)樣本發(fā)生交叉污染。在
流感流行季節(jié)前準(zhǔn)備該類病毒。如果在此期間必須補(bǔ)充這類病毒的話，必須與處理臨床
標(biāo)本的時(shí)間分開。應(yīng)盡量將已知病毒和未知材料在不同時(shí)間、不同生物安全柜、不同房
間進(jìn)行操作。
：
III.實(shí)驗(yàn)室污染的鑒定：由于試驗(yàn)室已知毒株和商用推薦病毒都是實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的，有良
好的生長(zhǎng)特性，通常滴度較高。用推薦血清做抗原分析和基因序列分析可以確定污染狀
況。
重要原則：
禁止在同一實(shí)驗(yàn)室，同一時(shí)間處理接種未知臨床標(biāo)本和已知標(biāo)準(zhǔn)病毒。
禁止在同一實(shí)驗(yàn)室，同一時(shí)間處理接種采自不同動(dòng)物的標(biāo)本；動(dòng)物標(biāo)本（如豬、禽等）
必須與人的標(biāo)本分別保存。
